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    HJ1001-2018水質三種大腸菌群測定酶底物法全文查看

    發布時間:2019-10-16 11:50:00  來源:優爾普儀器  瀏覽量:0

    本文共計有4595個文字,預計閱讀時間16分鐘

    關鍵詞:酶底物法檢測(www.eatlovemerry.com)

    [摘要]:2018年生態環境部發布了HJ1001-2018環境保護標準,標準是關于水質總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定-酶底物法,本文和大家分享此標準的全部內容。

      為貫徹《中華人民共和國環境保護法》和《中華人民共和國水污染防治法》,保護生態環境,保障人體健康,規范水中總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定方法,我國生態環境部制定了本標準。下面優爾普儀器就和大家分享一下該標準的發布稿全文。

    水質 總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定 酶底物法

    Water quality—Determination of total coliforms, fecal coliforms and Escherichia coli—Enzyme substrate method

    1 適用范圍

    本標準規定了測定水中總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的酶底物法。

    本標準適用于地表水、地下水、生活污水和工業廢水中總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定。

    本方法的檢出限為10MPN/L。

    2 規范性引用文件

    本標準引用了下列文件或其中的條款。凡是不注日期的引用文件,其有效版本適用于本標準。

    GB/T 6682 分析實驗用水規格和實驗方法

    GB/T 14581 水質 湖泊和水庫采樣技術指導

    HJ 494 水質 采樣技術指導

    HJ/T 91 地表水和污水監測技術規范

    3 術語和定義

    下列術語和定義適用于本標準。

    3.1 總大腸菌群 total coliforms

    37℃培養 24 h,能產生β-半乳糖苷酶(β-D-galactosidase),分解選擇性培養基中的鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)生成黃色的鄰硝基苯酚的腸桿菌科細菌。

    3.2 糞大腸菌群 fecal coliforms

    又稱耐熱大腸菌群(thermotolerant coliforms)。44.5℃培養 24 h,能產生β-半乳糖苷酶(β-D-galactosidase),分解選擇性培養基中的鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)生成黃色的鄰硝基苯酚的腸桿菌科細菌。

    3.3 大腸埃希氏菌 Escherichia coli

    俗稱大腸桿菌。37℃培養 24 h,能產生β-半乳糖苷酶(β-D-galactosidase),分解選擇性培養基中的鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)生成黃色的鄰硝基苯酚,同時產生β-葡萄糖醛酸酶(β-Glucuronidase),分解選擇性培養基中的 4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷2(MUG)釋放出熒光物質(4-甲基傘形酮)的腸桿菌科細菌。

    3.4 最大可能數 most probable number(MPN)

    又稱稀釋培養計數,是一種基于泊松分布的間接計數法。利用統計學原理,根據一定體積不同稀釋度樣品經培養后產生的目標微生物陽性數,查表估算一定體積樣品中目標微生物存在的數量(單位體積存在目標微生物的最大可能數)。

    4 方法原理

    在特定溫度下培養特定的時間,總大腸菌群、糞大腸菌群、大腸埃希氏菌能產生β-半乳糖苷酶,將選擇性培養基中的無色底物鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)分解為黃色的鄰硝基苯酚(ONP);大腸埃希氏菌同時又能產生β-葡萄糖醛酸酶,將選擇性培養基中的 4- 甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)分解為 4-甲基傘形酮,在紫外燈照射下產生熒光。統計陽性反應出現數量,查 MPN 表,分別計算樣品中總大腸菌群、糞大腸菌群、大腸埃希氏菌的濃度值。

    5 干擾和消除

    5.1 活性氯具有氧化性,能破壞微生物細胞內的酶活性,導致細胞死亡,可在樣品采集(8.1)時加入硫代硫酸鈉溶液(6.4)消除干擾。

    5.2 重金屬離子具有細胞毒性,能破壞微生物細胞內的酶活性,導致細胞死亡,可在樣品采集(8.1)時加入乙二胺四乙酸二鈉溶液(6.5)消除干擾。

    6 試劑和材料

    除非另有說明,分析時均使用符合國家標準的分析純試劑,實驗用水應滿足 GB/T 6682中三級水的要求。

    6.1 培養基。

    本標準采用 Minimal Medium ONPG-MUG 培養基。每100 ml樣品需使用培養基粉末2.7 g±0.5 g,所含基本成分如下:

    培養基成分培養基成分

    也可采用市售商品化培養基制品。

    6.2 硫代硫酸鈉(Na2S2O3·5H2O)。

    6.3 乙二胺四乙酸二鈉(C10H14N2O8Na2·2H2O)。

    6.4 硫代硫酸鈉溶液:ρ(Na2S2O3)=0.10 g/ml。

    稱取 15.7 g 硫代硫酸鈉(6.2),溶于適量水中,定容至 100 ml,臨用現配。

    6.5 乙二胺四乙酸二鈉溶液:ρ(C10H14N2O8Na2·2H2O)=0.15 g/ml。

    稱取 15 g 乙二胺四乙酸二鈉(6.3),溶于適量水中,定容至 100 ml,此溶液保質期為30d。

    6.6 97 孔定量盤:含 49 個大孔,48 個小孔。其中,每個小孔可容納 0.186 ml 樣品,大孔中 48 個大孔每個可容納 1.86 ml 樣品,一個頂部大孔可容納 11 ml 樣品。也可采用經環氧乙烷滅菌的市售商品化成品。

    6.7 標準陽性比色盤。

    6.8 無菌水:取適量實驗用水,經 121℃高壓蒸汽滅菌 20 min,備用。

    7 儀器和設備

    7.1 采樣瓶:具螺旋帽或磨口塞的 100 ml、250 ml、500 ml 廣口玻璃瓶。

    注:在采集不存在或不考慮余氧、金屬離子干擾的樣品時,可采用市售無菌采樣瓶或無菌采樣袋。

    7.2 高壓蒸汽滅菌器:121℃可調。

    7.3 恒溫培養箱:允許溫度偏差 37℃±1℃、44.5℃±0.5℃。

    7.4 程控定量封口機:用于 97 孔定量盤(6.6)的封口。

    立科程控定量封口機立科程控定量封口機

    7.5 紫外燈:365~366 nm。

    7.6 移液管:1 ml±0.01 ml、10 ml±0.1 ml。也可采用計量合格的可調式移液器。

    7.7 三角瓶:100 ml。

    7.8 量筒:100 ml±1 ml。

    7.9 一般實驗室常用儀器和設備。

    注:三角瓶、移液管、采樣瓶等玻璃器皿及采樣器具要在試驗前按無菌操作要求包扎,121℃高壓蒸汽滅菌 20 min,烘干,備用。

    8 樣品

    8.1 樣品采集

    點位布設及采樣頻次按照 GB/T 14581、HJ/T 494 和 HJ/T 91 的相關規定執行。

    采集微生物樣品時,采樣瓶(7.1)不得用樣品洗滌,采集樣品于滅菌的采樣瓶中。

    采集河流、湖庫等地表水樣品時,可握住瓶子下部直接將帶塞采樣瓶插入水中,約距水面 10~15 cm 處,瓶口朝水流方向,拔瓶塞,使樣品灌入瓶內然后蓋上瓶塞,將采樣瓶從水中取出。如果沒有水流,可握住瓶子水平往前推。采樣量一般為采樣瓶容量的 80%左右。樣品采集完畢后,迅速扎上無菌包裝紙。

    從龍頭裝置采集樣品時,不要選用漏水龍頭,采水前將龍頭打開至最大,放水 3~5 min,然后將龍頭關閉,用火焰灼燒約 3 min 滅菌或用 70%~75%的酒精對龍頭進行消毒,開足龍頭,再放水 1 min,以充分除去水管中的滯留雜質。采樣時控制水流速度,小心接入瓶內。

    采集地表水、廢水樣品及一定深度的樣品時,也可使用滅菌過的專用采樣裝置采樣。

    在同一采樣點進行分層采樣時,應自上而下進行,以免不同層次的攪擾。

    如果采集的是含有活性氯的樣品,需在采樣瓶滅菌前加入硫代硫酸鈉溶液(6.4),以除去活性氯對細菌的抑制作用(每 125 ml 容積加入 0.1 ml 的硫代硫酸鈉溶液);如果采集的是重金屬離子含量較高的樣品,則在采樣瓶滅菌前加入乙二胺四乙酸二鈉溶液(6.5),以消除干擾(每 125 ml 容積加入 0.3 ml 的乙二胺四乙酸二鈉溶液)。

    注:15.7 mg 硫代硫酸鈉(6.2)可去除樣品中 1.5 mg 活性氯,硫代硫酸鈉用量可根據樣品實際活性氯量調整。

    8.2 樣品保存

    采樣后應在 2 h 內檢測,否則,應 10℃以下冷藏但不得超過 6 h。實驗室接樣后,不能立即開展檢測的,將樣品于 4℃以下冷藏并在 2 h 內檢測。

    9 分析步驟

    9.1 樣品稀釋

    根據樣品污染程度確定接種量(見表 1),避免接種樣品培養后 97 孔定量盤(6.6)出現全部陽性或全部陰性。接種量小于 100 ml 時,應稀釋樣品后接種,接種量為 10 ml 時,取 10 ml 樣品加入到盛有 90 ml 無菌水(6.8)的三角瓶(7.7)中混勻制成 1:10 的稀釋樣品,其他接種量的稀釋樣品依次類推。對于未知樣品,可選用多個接種量進行檢測。

    樣品接種量參考表

    9.2 接種

    量取 100 ml 樣品或稀釋樣品于滅菌后的三角瓶,加入 2.7 g±0.5 g 培養基(6.1)粉末,充分混勻,完全溶解后,全部倒入 97 孔定量盤(6.6)內,以手撫平 97 孔定量盤背面,趕除孔內氣泡,然后用程控定量封口機(7.4)封口。觀察 97 孔定量盤顏色,若出現類似或深于標準陽性比色盤(6.7)的顏色,則需排查樣品、培養基、無菌水等一系列因素后,終止試驗或重新操作。

    注:9.1、9.2 步驟在野外操作時應避開明顯局部污染源,建議使用一次性手套、口罩、酒精燈等。

    9.3 培養

    測定總大腸菌群和大腸埃希氏菌時,將封口后的 97 孔定量盤放入恒溫培養箱(7.3)中37℃±1℃下培養 24 h。

    測定糞大腸菌群時,將封口后的 97 孔定量盤放入的恒溫培養箱中 44.5℃±0.5℃下培養24 h。

    9.4 對照試驗

    9.4.1 空白對照

    每次試驗都要用無菌水(6.8)按照步驟 9.1~9.3 進行實驗室空白測定。培養后的97孔定量盤不得有任何顏色反應,否則,該次樣品測定結果無效,應查明原因后重新測定。

    9.4.2 陰性和陽性對照

    總大腸菌群、大腸埃希氏菌、糞大腸菌群的陰性、陽性菌株參考表 2。

    陰性、陽性菌株參考表

    將標準菌株制成300~3000個/ml 的菌懸液,將菌懸液按接種(9.2)和培養(9.3)要求操作,陽性菌株應呈現陽性反應;陰性菌株呈現陰性反應,否則,該次樣品測定結果無效,應重新測定。

    注:可先制備較高濃度菌懸液,采用血球計數器在顯微鏡下對其濃度進行初步測定,然后根據實際情況用無菌水(6.8)稀釋至 300~3000 個/ml。

    9.4.3 結果判讀與計數

    將培養24h后的97孔定量盤進行結果判讀,樣品變黃色判斷為總大腸菌群或糞大腸菌群陽性;樣品變黃色且在紫外燈(7.5)照射下有藍色熒光,判斷為大腸埃希氏菌陽性。如果結果可疑,可延長培養至28h進行結果判讀,超過 28 h 后出現的顏色反應不作為陽性結果??墒褂帽Y|期內的標準陽性比色盤以輔助判讀,參見附錄 A。

    分別記錄97孔定量盤中大孔和小孔的陽性孔數量。

    10 結果計算與表示

    10.1 結果計算

    從97孔定量盤法MPN表中查得每100ml樣品中總大腸菌群、糞大腸菌群數或大腸埃希氏菌的MPN值(置信區間參見附錄C)后,再根據樣品不同的稀釋度,按照公式(1)換算樣品中總大腸菌群、糞大腸菌群數或大腸埃希氏菌濃度(MPN/L):

    大腸菌群濃度計算公式大腸菌群濃度計算公式

    10.2 結果表示

    測定結果保留兩位有效數字,當測定結果≥100 MPN/L 時,以科學計數法表示;若 97孔均為陰性,可報告為總大腸菌群、糞大腸菌群數或大腸埃希氏菌未檢出或<10 MPN/L。

    11 精密度和準確度

    11.1 精密度

    6 個實驗室分別對低濃度(地下水,濃度均值為 6.0×100MPN/L)、中濃度(地表水,濃度均值為 4.0×10000 MPN/L)和高濃度(生活污水,濃度均值為 9.0×10000000MPN/L)三個不同濃度細菌總數的樣品及有證標準樣品(濃度為 2000 MPN/L)進行了 6 次重復測定:實驗室內相對標準偏差范圍分別為 0.26%~1.3%、0.65%~2.0%、1.3%~3.7%和 0.68%~2.8%;實驗室間相對標準偏差分別為 9.9%、1.3%、4.2%和 1.3%;重復性限為 0.17、0.18、0.21 和 0.18;再現性限為 1.8、0.23、0.38 和 0.20;實驗室間置信區間見表 3。

    總大腸菌群實驗室間95%置信區間表

    6個實驗室分別對低濃度(地下水,濃度均值為70MPN/L)、中濃度(地表水,濃度均值為 9.0×1000MPN/L)和高濃度(生活污水,濃度均值為 2.0×1000000MPN/L)三個不同濃度細菌總數的樣品及有證標準樣品(濃度為 2000MPN/L)進行了 6 次重復測定:實驗室內相對標準偏差范圍分別為 0.69%~1.9%、0.93%~2.9%、5.4%~21%和 1.8%~3.0%;實驗室間相對標準偏差分別為 9.6%、1.6%、15%和 3.7%;重復性限為 0.23、0.21、0.58 和 0.19;再現性限為 1.7、0.26、0.90 和 0.35;實驗室間置信區間見表 4。

    大腸埃希氏菌實驗室間置信區間表

    6個實驗室分別對低濃度(地下水,濃度均值為 1.0×100MPN/L)、中濃度(地表水,濃度均值為 1.3×10000MPN/L)和高濃度(生活污水,濃度均值為 3.0×1000000MPN/L)三個不同濃度細菌總數的樣品及有證標準樣品(濃度為3700MPN/L)進行了 6 次重復測定:實驗室內相對標準偏差范圍分別為 0.40%~2.4%、1.3%~2.9%、3.4%~17%和 2.4%~9.2%;實驗室間相對標準偏差分別為 8.9%、6.4%、6.6%、6.4%;重復性限為 0.22、0.26、0.58 和 0.55;再現性限為 1.6、0.76、0.64 和 0.75;實驗室間置信區間見表 5。

    糞大腸菌群實驗室間置信區間表

    11.2 準確度

    6家實驗室對總大腸菌群有證標準樣品(2000 MPN/L)進行了 6 次重復測定:實驗室內的相對誤差范圍為-6.4%~-3.5%;相對誤差的最終值為-4.7%±1.2%。

    6家實驗室對大腸埃希氏菌群標準樣品(2000 MPN/L)進行了 6 次重復測定:實驗室內的相對誤差范圍為-15%~-6.3%;相對誤差的最終值為-13%±3.3%。

    6家實驗室對糞大腸菌群的有證標準樣品(3700 MPN/L)進行了 6 次重復測定:實驗室內的相對誤差范圍為-17%~-0.81%;相對誤差的最終值為-13%±6.1%。

    注:微生物檢測數據為偏態分布,其測定結果全部經以 10 為底對數轉換后進行計算。

    12 質量保證和質量控制

    12.1 每批樣品按對照試驗(9.4)進行空白對照測定,定期使用有證標準菌株進行陽性和陰性對照試驗。

    12.2 每 20 個樣品或每批次樣品(≤20 個/批)測定一個平行雙樣。

    12.3 對每批次培養基須使用有證標準菌株進行培養基質量檢驗。

    12.4 定期使用有證標準菌株/標準樣品進行質量控制。

    13 廢物處理

    實驗中產生的廢物經 121℃高壓蒸汽滅菌 20 min 后,作為一般廢物處理。

    總大腸菌群、糞大腸菌群酶底物法陰性、陽性結果參考圖

    大腸埃希氏菌酶底物法陰性、陽性結果參考圖

      以上就是HJ1001-2018水質 總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定 酶底物法發布稿標準的全部內容了,有需要的朋友可以參考。

    標題:HJ1001-2018水質三種大腸菌群測定酶底物法全文查看      地址:http://www.eatlovemerry.com/news/58.html
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